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王敦于不久后患病，因会稽内史周札一族势力强盛，便采纳钱凤的建议，决定铲除周氏，为后嗣子孙消除祸患。他指使庐江太守李恒，诬称周氏勾结妖道李弘图谋不轨。当时，周札的侄子周筵正在王敦的军府担任谘议参军。王敦遂在军中将周筵收捕处死，同时命沈充前往义兴尽杀周氏子弟，随后又进兵突袭会稽，攻杀周札。后来，王敦又杀害司马绍的心腹冉曾、公乘雄等人，并以“三番休二”的方式减少宿卫的当值兵力。
王敦病势愈来愈重，遂矫诏拜养子王应为武卫将军，作为自己的继承人。他认为王应年少难当大事，在与钱凤等谋划后事时提出了三套方案：上策为放弃兵权，复归朝廷；中策为退回武昌，拥兵自守；下策为举兵东下，颠覆朝廷。钱凤却认为下策才是最好的计谋，遂与沈充决定在王敦死后发动叛乱。而与此同时，司马绍一面命侍中陈晷、散骑常侍虞騑去探问王敦病况，一面却微服到芜湖察看王敦大军的营垒预作讨伐的准备，还不断派遣大臣去询问王敦的起居。
公元324年）六月，王敦以左司马温峤为丹阳尹，意图借此监视朝廷动静。但温峤却将王敦的谋划尽数禀报给司马绍。司马绍当即决定讨伐王敦，亲自驻屯于台城宣阳门外的中堂，并作出一系列军事部署：
以王导为大都督，总领征讨诸军。以郗鉴为卫将军，统领从驾诸军，以温峤为中垒将军，与右将军卞敦负责守卫石头城。以光禄勋应詹为护军将军，负责守卫建康城南的朱雀桥。
命徐州王邃、豫州祖约、兖州刘遐、临淮苏峻、广陵陶瞻等边军镇将率部入卫建康。
司马绍为了消除将士对王敦的畏惧之心，对外宣称王敦已死，只是以钱凤为讨伐对象。王导亦率宗族子弟为王敦发丧。晋军将士对王敦的“死讯”信以为真，登时士气大振。
王敦大怒，遂以诛杀温峤等奸臣为名，再次举兵。他此时病势沉重不能领兵，便以王含为元帅，与钱凤、邓岳、周抚等率五万大军向建康进发，并暗示钱凤等在破城后杀死司马绍。沈充亦于吴兴起兵，直趋建康。
王含、钱凤等军水陆并进，很快便攻至建康，屯于秦淮河南岸。温峤移驻北岸，因宿卫兵力薄弱而所征边军尚未抵达，下令烧毁朱雀桥，与叛军隔河对峙。[94]王导期间曾试图劝降王含，但未能成功。
不久，司马绍出屯南皇堂，命将军段秀和中军司马曹浑等率数千甲卒，乘夜渡河袭击叛军，在越城大败王含，斩杀其前锋将领何康。王敦闻败震怒，欲强撑病体亲赴前线督战，最终因病重乏力而未能成行。
